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2024年7月山东大学丁兆军教授团队在Advanced Science（IF=14.3）杂志上发表题为“VIK-Mediated Auxin Signaling Regulates Lateral Root Development in Arabidopsis”文章。研究采用磷酸化修饰组学、LC-MS/MS质谱分析、CO-IP、酵母双杂和荧光素酶互补成像等技术，发现VIK介导的生长素信号转导分别通过增强LBD18的蛋白质稳定性和诱导ERF13的降解来调节侧根发育。拜谱生物为该研究提供了磷碱化绘制组学、LC-MS/MS磷碱化位点剖析技术服务。
日文标题格式：VIK-Mediated Auxin Signaling Regulates Lateral Root Development in Arabidopsis（Advanced Science，IF=14.3，2024.07）
中文名字版头：VIK介导的生长素信号调节拟南芥侧根发育
业主企业单位：山东大学
研究探讨建材：拟南芥侧根
拜谱给出技巧：磷过酸体现组学、LC-MS/MS磷过酸位点深入分析
科研工作思路：
PART 01 学习结论
01、成长素提高网站VIK的磷酸性反应举例转录
为了鉴定生长素触发的潜在磷酸化调控因子，作者对10日龄拟南芥幼苗根用10 µM 萘乙酸（NAA）处理15分钟和8小时后进行磷碱化淀粉酶质酚类化合物析，结果发现VIK可能通过磷酸化修饰在介导生长素信号传递中发挥关键作用（图1A）。
图1 种植素力促VIK的磷硝化作用下列不属于转录
为了验证上述结果，作者在大肠杆菌中表达了带有6个组氨酸标签的重组VIK蛋白（His-VIK），并在细胞自由蛋白系统中进行了磷碱化科学实验。发现His-VIK随着时间的推移磷酸化水平略有增加。在野生型拟南芥幼苗的根组织裂解液中，NAA处理15分钟和30分钟后，His-VIK的磷酸化水平显著增加，表明生长素能显著促进VIK的磷酸化（图1B）。
通过鲜酵母双杂交种定性分析（Y2H）和烟草叶片中的荧光素酶互补性成相试验（LCI）证实了VIK与TMK1之间存在直接相互作用，并且体内磷过酸实验表明TMK1可以磷酸化VIK。通过生成ProVIK:VIK-GFP转基因系进行的蛋白降解实验显示生长素可能不影响VIK蛋白的稳定性（图1C）。实时更新参考值PCR分析发现，生长素处理能时间依赖性地诱导VIK转录水平的增加（图1D），且这种诱导主要通过ARF7/19依赖性方式实现，在arf7/19突变体中VIK表达的诱导明显减弱，而在lbd16/18/33突变体中VIK表达仍能被生长素显著诱导。
02、VIK 介导的叶绿素讯号主动房产调控 LR 健康
可以通过解析两位VIK T-DNA嵌入变化体（vik-2和vik-3），找到与野山型相较，变化体的LR比热容、LR原基（LRP）和已健康的LR正相关少，愈加是vik-2（图2）。颠倒，过形容VIK的转表观遗传主茎特征出LR比热容增大。最后，在vik-2变化体大环境下形容VIK的转表观遗传主茎医治了LR健康缺欠。植物的产生素处置实验性证明，vik-2变化体对植物的产生素诱导型的LR健康发应削弱，证明VIK在植物的产生素政策调控LR健康中引领核心效用。 
图2 VIK介导的发芽素4g信号通道正面宏观调控LR的发育成熟
03、VIK 与ERF13 完成物理上的交互性
研究发现VIK在生长素诱导的侧根（LR）发育中扮演关键角色，因此推测ERF13可能是VIK的潜在底物。通过Y2H、LCI、双原子核荧光互补式 （BiFC）和免疫抗体共积累调查（CO-IP），证实了VIK与ERF13之间存在直接的相互作用（图3）。这些结果表明VIK与ERF13在物理上相互作用，支持了ERF13可能是VIK作用底物的假设。
图3 VIK与ERF13共同意义
04、VIK以双面馈的玩法调节作用ERF13磷过酸
通过磷硝化作用淀粉酶组学数据分析，发现NAA处理可快速诱导ERF13磷酸化。体外实验表明，VIK具有自磷酸化活性，并可直接磷酸化ERF13的Ser168和Ser172位点（图4）。点突变性出现显著降低了ERF13的磷酸化水平。此外，ERF13可增强VIK的自磷酸化，尤其是ERF13的磷酸模拟突变体。进一步实验表明，VIK可通过形成同源二聚体进行自磷酸化，但ERF13突变体不影响VIK二聚体的形成。总体而言，VIK通过反馈机制调控ERF13的磷酸化。
图4 VIK以双面馈的方法磷酸性反应ERF13的Ser168和Ser172位点
05、VIK介导的磷硝化作用推进ERF13吸附
研究发现，VIK介导的磷酸化作用影响ERF13蛋白的稳定性，进而调控侧根发育。实验显示，ERF13蛋白在早期侧根原基中表达，随后在发育过程中消失，而VIK蛋白在所有侧根中持续表达（图5）。通过休外實驗和机体實驗，发现VIK能够促进ERF13的降解。进一步通过磷酸模拟系统和磷酸灭活变动体的实验，证实了ERF13在Ser168和Ser172位点的磷酸化促进了其降解。此外，VIK与MPK14可能协同作用促进ERF13降解，但两者之间没有直接的相互作用。最后亚細胞准确定位具体分析表明，ERF132D和ERF132A均位于细胞核，且与WT无明显差异。qRT-PCR结果显示，vik-2突变体中ERF13 mRNA水平未显著变化，但其下游基因KCS8和KCS16显著降低，进一步证明VIK在蛋白水平上调控ERF13。总之，VIK介导的磷酸化通过负调控ERF13的稳定性，加速生长素诱导的ERF13降解。
图5 VIK 介导的磷硝化作用会加快了ERF13降解塑料
06、VIK 介导的 ERF13 磷过酸调低 LR 的出显
的研究全面骤浅析了VIK调整的ERF13吸附在侧根（LR）发育成熟中的的的效果。确认有点不一样的转dna蕨类藤本绿植系的LR表型，有 了过描述ERF13减缓了LR的出来，在vik突然变化体中这个减缓的的效果增強，而在过描述YFP-VIK的游戏背景下这个减缓的的效果衰弱（图6）。不仅，有点ERF13的不一样的磷碱化仿真模拟仿真和磷酸解离遗传变异体的过描述蕨类藤本绿植系，有 了ERF132A-Myc（磷酸解离）的蕨类藤本绿植系LR出来较少，而ERF132D-Myc（磷碱化仿真模拟仿真）的蕨类藤本绿植系LR出来略多。那些可是得出结论，VIK介导的ERF13磷碱化和吸附带动了LR的出来。 
图6 VIK介导的ERF13磷碱化有利于LR的现身
07、VIK在侧根成长中磷酸性反应并稳固LBD18蛋白酶
确认探讨多个VIK T-DNA插入图突然变化体（vik-2和vik-3），出现 与天然的型差距，突然变化体的侧根（LR）高比热容、LR原基（LRP）和已大的LR有明显极大减少，还是比较是vik-2（图7）。不同，过证实VIK的转染色体植物体成绩出LR高比热容加强。除此以外，在vik-2突然变化体大环境下证实VIK的转染色体植物体恢复过来了LR大一些缺陷。产生素净化处理實驗证实，vik-2突然变化体对产生素介导的LR大反映降低，证实VIK在产生素房产调控LR大中挥发关键性帮助。 
图7 VIK 在LR生成的过程中随时磷硝化作用和稳定可靠LBD18蛋白质
PART 02 论文总结ppt
生长素作为最重要的植物激素之一，在调控植物生长和发育过程中起着关键作用。这项研究通过磷酸性反应血清质组学研究分析筛选到快速响应生长素的蛋白激酶VIK，并证实VIK通过调控LBD18和ERF13来调控侧根的形成。一方面，生长素以ARF7/19依赖的方式诱导VIK的转录；另一方面，它通过TMK1激活VIK的激酶活性，激活的VIK可以磷酸化LBD18和ERF13。磷酸化的LBD18变得更加稳定，调节侧根的启动。然而，磷酸化的ERF13经历降解，缓解了其对侧根出现的抑制，从而促进侧根的形成（图8）。VIK的发现不仅丰富了我们对生长素信号传递机制的理解，而且为农业生产中通过调控生长素信号来提高作物产量和抗逆性提供了潜在的策略。
图8 VIK介导的滋生素走势调理侧根进行
PART 03 拜谱个人心得体会
研究采用磷酸化修饰组学、LC-MS/MS质谱分析、CO-IP、酵母双杂和荧光素酶互补成像等技术，发现 VIK 介导的生长素信号转导分别通过增强 LBD18 的蛋白质稳定性和诱导 ERF13 的降解来调节 LR 发育。拜谱生物作为一家国内领先的多组学服务公司，可提供完善成熟的淀粉酶质组学、表达淀粉酶质组学、产生组学、转录组学等多组学产品技术服务体系。拜谱特色磷酸化修饰产品—极高强度DIA·磷硝化作用绘制组，采用创新含有技艺+Astral DIA，超高深度赋能低丰度磷酸化蛋白/位点发掘，单针最高可实现哺乳动物范本10w+、草本花卉范本5w+磷酸化修饰位点检出，可广泛应用于植物、动物研究，绘制物种磷酸化修饰图谱，助力高分文章发表。此外，磷酸化修饰组学可与蛋白组学、代谢组学等多组学联合，整合多组学数据进行深入挖掘分析，全面解析机制机理等。欢迎咨询！
参看学术论文：
Shang E, Wei K, Lv B, Zhang X, Lin X, Ding Z, Leng J, Tian H, Ding Z. VIK-Mediated Auxin Signaling Regulates Lateral Root Development in Arabidopsis. Adv Sci (Weinh). 2024 Jul 3:e2402442. doi: 10.1002/advs.202402442. Epub ahead of print. PMID: 38958531.
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